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细胞如何转染?你知道吗?
点击次数:138 发布时间:2019-02-19

    转染 ,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技能。随着基因与蛋白功用研讨的深化,转染目前已成为试验室工作中常常涉及的根本办法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微打针和基因枪归于通过物理办法将基因导入细胞的范例;化学介导办法许多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染办法、和多种阳离子物质介导的技能;生物介导办法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技能。

    抱负细胞转染办法,应该具有转染功率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技能,是目前转染功率的办法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染办法的准备程序杂乱,常常对细胞类型有很强的挑选性,在一般试验室中很难遍及。其它物理和化学介导的转染办法,则各有其特色。

    需求指出的一点,无论采用哪种转染技能,要取得zui优的转染成果,或许都需求对转染条件进行优化。影响转染功率的因素许多,从细胞类型、细胞培育条件和细胞生长状况,到转染办法的操作细节,都需求考虑。

一、细胞传代
1.试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培育皿,离心管。
2.弃掉培育皿中的培育基,用1ml的PBS溶液洗刷两次。
3.用Tip头参加1ml Trypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培育瓶壁,调查到细胞彻底从壁上脱落下来为止。
4.参加1ml的含血清培育基停止反应。
5.用Tip头多次吹吸,使细胞彻底分散开。
6.将培育液装入离心管中,1000rpm离心5min。
7.用培育液重悬细胞,细胞计数后挑选0.8X106个细胞参加一个35mm培育皿。
8.将适宜体积彻底培育液参加离心管中,混匀细胞后悄悄参加培育皿中,使其均匀分布。
9.将培育皿转入CO2培育箱中培育,第二天转染。

二、细胞转染
1.转染试剂的准备
① 将400ul去核酸酶水参加管中,震动10秒钟,溶解脂状物。
② 震动后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震动。

2。挑选适宜的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中参加适宜体积的无血清培育基。参加适宜质量的MyoD或者EGFP的DNA,震动后在参加适宜体积的转染试剂,再次震动。

3. 将混合液在室温放置10―15分钟。

4. 吸去培育板中的培育基,用PBS或者无血清培育基清洗一次。

5. 参加混合液,将细胞放回培育箱中培育一个小时。

6. 到时后,依据细胞品种决议是否移除混合液,之后参加彻底培育基持续培育24-48小时。

三、第2次细胞传代
1. 在转染后24小时,调查试验成果并记录绿色荧光蛋白表达状况。

2。 再次进行细胞传代,依照免疫染色适宜的密度0。8X105个细胞/35mm培育皿将细胞从头转入培育皿中。

3。 在正常条件下培育24小时后依照染色要求条件固定。 

 

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